实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文
1993 年，Higuchi 等人将PCR 技术和封闭式检测相结合，对目的核酸数量进行定量分析，提出了荧光定量PCR 技术的概念。1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，达到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR 技术才得以真正的推广和应用。到目前为止，实时荧光定量已被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等科学领域。
1 原理
Real-Time PCR 是在PCR 反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号对整个PCR 进程进行实时监测，从而达到对未知起始模板进行定量分析的目的。它是一种将酶动力学、核酸扩增、光谱分析和实时检测技术相结合的技术。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号，这样就可以通过荧光信号强度变化实时监测PCR 产物量的变化，从而得到一条描述PCR 动态进程的曲线，即扩增曲线。
实 时荧光定量PCR 扩增曲线可以分为4 个阶段: 基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，见图1。在基线期( 通常1 ～ 15 个循环) ，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化; 早期指数期，荧光信号超过背景信号并到达阈值( 通常为基线信号标准偏差的10 倍) ，此时循环数称为Ct( Cycle threshold) 值或Cp( Crossingpoint) 值，Ct值与模板起始浓度的对数值成反比线性关系，因而Ct值可被用来定量模板起始浓度; 对数-线性期，在理想反应条件下每经历一个循环，PCR 产物加倍; 平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始模板拷贝数。实时荧光定量PCR 能准确地确定初始模板拷贝数，结果重现性好，误差小，与常规PCR 在终点定量上相比更具重要意义。实时荧光定量PCR 结果不仅可以定性( 判断一段序列的存在与否) ，还可定量( 确定基因的拷贝数) ，而常规PCR 只能做到半定量。另外，实时荧光定量PCR 的反应和检测都是在封闭的反应管中进行的，样品污染几率大大降低，无需扩增后的实验操作，大大节省了实验时间，提高了实验效率。
2 Real-Time PCR 定量类型
实时荧光定量分析包括绝对定量和相对定量。绝对定量是对未知样品绝对拷贝数进行测定的方法;相对定量不是测定样品的绝对拷贝数，而是比较样品之间同一目的基因的相对表达量，以期分析样品之间目的基因的表达差异。
2. 1 绝对定量
绝对定量是使用一系列已知浓度( 通常为5 ～ 6个梯度稀释的浓度) 的标准品绘制标准曲线，建立Ct值与起始模板量[总核糖核酸( RNA) 或脱氧核糖核酸( DNA) ] 的对数值之间的线性关系，达到对未知样品绝对的定量。标准曲线的绘制首先是标准品的选择，标准品可以是DNA( 重组质粒DNA、基因组DNA、纯化的RT-PCR 产物及合成的寡核苷酸DNA) 或RNA( 体外转录RNA[5，8-10]) 。但是为了保持与待测样品间扩增效率的一致性，标准品应尽量选择与待测样品结构近似的样品，该方法要求梯度稀释的标准品都必须与待测样品同时平行扩增，且待测样品浓度应包含在已知标准品浓度范围之内。
2. 2 相对定量
相对定量解析方法相对复杂，一般用于基因表达分析。根据选用的标准不同可分为以质量单位为标准的相对定量和以内参基因为标准的相对定量。以质量单位( 细胞的数目或核酸的微克数) 作为标准的相对定量优点是实验设计概念简单，数据分析处理简单易学，缺点是很难准确量化初始材料; 而以内参基因作为标准的相对定量优点是能准确量化初始材料的载量，尤其当初始材料受限时，进行相对表达分析十分方便。缺点是要求得到一个或多个在所有待测样本中恒定表达的内参基因。目前，使用较多的是以内参基因作为标准的定量方法。
2. 2. 1 内参基因的稳定性评价为了确保定量结果的可靠性和准确性，在qRT-PCR 中需选择合适的内参基因对不同样品之间因质量、RNA 的提取效率以及反转录效率不同所产生的差异进行校正，从而实现对不同样品中RNA 的定量和数据归一化。理想的内参基因应满足以下条件: 1) 在不同发育阶段和不同组织器官中表达稳定; 2) 表达不受生物学、实验条件的影响; 3) 其稳定的表达水平与目的基因表达水平相近。在植物qRT-PCR 研究中用的最多的内参基因通常是看家基因( housekeepinggenes) ，然而越来越多的研究表明，看家基因在不同类型细胞和不同生理状态下的表达并不是恒定不变的，若盲目选择看家基因作为内参，可能会导致基因表达分析结果不准确，甚至得到相反的或者错误的结论。因此选择合适的、稳定的内参用于基因表达的差异分析非常关键。目前，geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT等分析方法被广泛用于内参基因的筛选与评价。Xie 等将上述4 种方法整合成一个在线的分析工具—RefFinder，用于各种实验条件下内参的筛选，避免了单个分析方法的片面性。
2. 2. 2 引物的特异性及扩增效率的检测为了使结果准确可靠，qRT-PCR 中还要求引物的特异性好，扩增效率接近100%。刘正霞等研究显示，引物的特异性和扩增效率对定量PCR 结果分析有显著影响。
引物的特异性评估: 引物的特异性可以通过凝胶电泳、PCR 产物克隆测序以及qRT-PCR 的熔解曲线来检查。凝胶电泳的条带若为单一条带，则说明PCR 产物特异性好，若有多条则说明特异性差，需要优化PCR 反应条件和体系或重新设计引物; PCR产物克隆测序结果在去除载体序列后与原序列进行比对，分析测得的序列是否位于上下游引物之间;在qRT-PCR 中，可以通过熔解曲线来判断引物的特异性，若熔解曲线为单峰则说明引物的特异性好。通过上述3 种方法均可以对设计的引物进行特异性检测，以便筛选特异性较好的引物进行后续实验。扩增效率的计算: 相对定量结果的准确性还受到目的基因和内参基因的PCR 扩增效率影响。一般来说，扩增效率接近100%是优化实验使得结果重复性好且可靠的最好标志。实际操作时，反应的扩增效率应该在90% ～ 105%之间，如果扩增效率低，可能原因是引物设计不佳，或是反应的条件没有优化;扩增效率大于100%时，可能的原因有非特异性产物扩增，如引物二聚体、错配等引起的PCR 产物产生。传统计算扩增效率的方法是将已知模板稀释成一系列梯度浓度( 不少于5 个点) ，并进行实时荧光定量PCR 实验，利用拷贝数的对数值和Ct值建立标准曲线。评价标准曲线的.优劣有两个指标，相关系数( r) 和斜率。相关系数反映标准曲线的直线性，越接近1 说明直线性越好，定量越精确; 斜率与扩增效率相关，计算公式: 扩增效率( E) = 10( - 1 /斜率) - 1。在PCR 过程中，扩增效率在指数期相对稳定，但是随着循环数的增加，Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸( dNTP) 、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，扩增效率也就越来越趋向于0。通过标准曲线得出的扩增效率不能反映PCR 进程中扩增效率的变化。由于PCR 结果往往是通过Ct值来计算的，由扩增效率引起的最终差异只能反映在Ct值上的变化。
为了减小这种情况引起的误差，在定量时确保各样品浓度值在一系列梯度浓度的范围内，即Ct值在标准曲线范围内。此外，尚有根据PCR 进程中的原始数据或扩增曲线的形状，再基于不同的数学算法开发出来的一些软件来计算扩增效率的。这些算法或软件使得扩增效率的计算更加简单易行，特别是对于那些表达量很低的基因很难通过一系列的梯度稀释来求扩增效率。该方法缺点是不同软件基于的算法不同，因此各软件得到的结果也有差异; 噪音导致可用的数据点很有限，计算的扩增效率也就不精确。
2. 2. 3 数据处理方法对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，在这里只讨论以内参基因为标准的相对定量方法。常用的方法有双标准曲线法、2-△△Ct法、用参照基因的△Ct法和Pfaffi 法，应用每种方法必须对应适应的条件。双标准曲线法: 首先分别对目的基因和看家基因的5 个( 尽量不少于5 个点) 浓度梯度稀释的标准品制作两条标准曲线。各待测样品与标准品同时进行反应，得到目的基因的Ct值，分别代入目的基因的标准曲线，得到看家基因的Ct值，分别代入看家基因的标准曲线，这样就可以换算出各待测样品目的基因和看家基因的起始模板量。其次，利用内参对各待测样品进行归一化，即用目的基因的定量结果除以看家基因的定量结果。最后对不同样品之间目的基因的表达量进行比较，通常将对照样品的表达量作为1，计算出相对量，再进行样品间相对量比较。2-△△Ct ( Livak) 法: 2-△△Ct 法是定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，但条件是目的基因和内参基因扩增效率都接近100%，且相互间效率偏差在5% 以内，否则会产生较大的误差。
使用2-△△Ct 法之前，必须验证目的基因和内参基因的扩增效率。其操作步骤如下: 首先，对所有的待测样品和对照样品，用内参基因的Ct值归一化目的基因的Ct值: △Ct = Ct( 目的基因) - Ct( 内参基因) ; 其次，用对照样品的△Ct值归一化待测样品的△Ct值: △△Ct =△Ct( 待测样品) -△Ct( 对照样品) ; 最后，计算表达水平比率: 表达量的比值= 2 -△△Ct。如果目的基因和内参基因有同样的扩增效率，但是扩增效率不等于2，那么2 -△△Ct 法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的2。如果目的基因和内参基因扩增效率不相近，可以优化或重新设计实验。用参照基因的△Ct法: 用参照基因的△Ct法是2 -△△Ct法的一种变化形式，它更容易掌握且结果相同。与2 -△△Ct得到的△Ct值相比，△Ct法是每个样本之间参照基因与目的基因的Ct值的差值。虽然这种方法的操作步骤简单，但同样也能真实衡量基因表达水平，将参照基因的表达水平计算在内。结果显示，主要的差异是校准样本的表达水平不是1。如果用这个方法得到的表达值除以所选的校准样本的表达值，计算结果与2 -△△Ct 法的结果正好相同，即表达量的比值= 2( △Ct( 内参基因) -△Ct( 目的基因) )Pfaffi 法: 当目的基因和内参基因的扩增效率相近时，用2 -△△Ct法定量相对基因表达是最合适的方法，但是如果两个扩增子扩增效率不同，必须选择另一种方法来确定不同样本之间目的基因的相对表达量。Pfaffi 法则是目前最好的选择方法，计算公式为:表达量的比值= C( A - E) /D( F - B) ( C 和D 分别是目的基因和内参基因的扩增效率; A 和E 分别是对照样品和待测样品中目的基因的Ct值; F 和B 分别是待测样品和对照样品中内参基因的Ct值) 。
2. 2. 4 归一化归一化是对所有样品之间的差异进行校正。不同的样品，即使反应时使用相同量的总RNA，但因细胞来源不同，RNA 总表达量并非一致。因此仅仅将反应时RNA 量统一，起始的细胞数也不一定相同。其实在进行表达量分析时，比较的是相同数量细胞中的某个基因拷贝数目。实际上要将样品材料统一到相同细胞数提取是非常困难的，同时还不能保证RNA 提取效率、反转录效率以及PCR 扩增效率完全相同。基于上述原因，在进行表达量分析时，有必要选择内参基因对所有样品进行归一化处理，以获得目的基因特异性表达的真正差异。
筛选出稳定的内参基因后，先对目的基因归一化处理，然后进行表达差异分析。目前进行归一化分析的方法有两种: 单基因归一化和多基因归一化。实时荧光定量最早被用于基因表达差异分析时，大多文献报道都是以单个基因作为内参基因，对目的基因的表达量进行归一化。然而，基于单一内参基因进行归一化存在许多缺点，可能导致比较大的误差。因此，多个看家基因开始被应用于归一化分析中。
3 在中药领域中的应用
3. 1 基因表达分析
荧光定量PCR 最普遍的应用是基因表达分析。从基础科学研究到实际应用，检测基因表达都是基本的也是很重要的一项工作。Olofsson 等对黄花蒿不同组织中萜类代谢途径上的基因进行表达差异分析，为评估青蒿素的前体对青蒿素产量的影响提供科学参考。植物在生物和非生物胁迫下，基因表达水平的相对变化与次生代谢产物累积相关性的研究越来越受到科研工作者的青睐。如Cheng 等用YE、Ag + 和MeJA 3 种诱导子组合诱导丹参毛状根。结果发现，在处理24、36 h 后，SmCPS 的表达量显著上调，次生代谢产物隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的含量也随之显著上升，这表明丹参酮类化合物含量的升高可能与SmCPS 基因表达量的上调有关。在植物的不同发育阶段，其次生代谢产物的累积量及基因的表达水平也会不同。如Kim 等对人参在叶片不同开放期( 闭合阶段、中间阶段、全开放阶段) 其体内人参皂苷及生物合成途径上的关键酶基因进行检测。结果显示，在中间阶段和全开放阶段人参皂苷生物合成途径上的酶基因PgSS 和PgSE 的表达量比闭合阶段增加约1. 5 倍，PgDDS 的表达量则增加4 倍以上; 主根和侧根中，人参皂苷的含量在叶片开放的中间阶段达到最大值，而叶片中人参皂苷的含量在全开放阶段达到最高。此外，实时荧光定量的差异表达分析在中药领域得到广泛应用，如在甘草、黄花蒿等药用植物中都有大量的研究。
3. 2 中药品种及真伪鉴别
中药的真伪直接影响临床用药的准确性和中药的质量，因此对于中药品种真伪的鉴别历来是中药研究中极为重要的工作。Xue 等依据骨碎补的正品及其混淆品trnLtrnF间隔序列，设计Scorpion 探针，通过实时荧光定量对骨碎补的真伪进行鉴别，同时对多个混合样品( 正品中加入一种混淆品，按一定比例梯度混合)建立标准曲线，以分析正品中混淆品的掺入量。另外，Xue 等基于升麻及其替代品之间内转录间隔区( ITS) 序列的长度、鸟嘌呤( G) 、胞嘧啶( C) 含量的差异，采用LightCycler 定量仪扩增升麻及其替代品的ITS 序列，并分析各产物的熔解曲线。通过解链温度的差异区分鉴别升麻及其替代品，为快速、稳定鉴别升麻及其替代品建立了标准。董玉茹等将限制性内切酶引入熔解曲线分析中，建立了一种新的单核苷酸多态性( SNP) 分型方法，成功实现了对金银花与山银花、白术与苍术品种及真伪的鉴别。此外，有研究者基于实时荧光定量PCR 技术，分别对铁皮石斛近缘种冒充铁皮石斛以及三七粉掺假等现象建立快速的检测方法。
4 小结
植物在生长、发育及受外界环境刺激等过程中，其基因在不同时空的表达存在着很大差异。对基因的表达量进行差异分析，是了解生物体生长、发育和调控等机理的一个重要内容。Northern 杂交、Southern 杂交和原位杂交等都可以用来进行目的基因的定量分析，但这些方法耗时且敏感性较差。普通PCR 终点定量的缺陷是扩增出来的DNA 产物需要通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭( EB) 染色后才可以显示出来，这些步骤耗时且不易精确定量。此外，由于酶动力学的特点，在PCR 反应进程中有基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，理论上来说，所有样本的DNA 扩增量最后是相同的，但实际上，不同样本的平台期是不一样的。在这种情况下，通过终点定量分析，反而将反应效率中很小的差别放大出来，造成定量的不准确。实时荧光定量为起始定量，误差相对较小，这使其在定量方面得到快速的发展。PCR 产物长度或组成不同，其熔解曲线( 熔链温度) 也存在差异，因此可根据熔解曲线的差异进行物种的鉴别。中药鉴定要解决其中一个很重要的问题就是真伪。实验过程中，我们可通过设计特异性引物来扩增不同的样品，从而得到不同的PCR 产物，再根据相应的熔解曲线鉴定中药材的真伪和掺伪的中药材。此外，实时荧光定量PCR 还可广泛用于等位基因分析及转基因生物检测等。
实时荧光定量PCR 自建立以来，发展迅速、应用广泛，拥有许多优点。近年来，许多科研工作者基于实时荧光定量PCR 的基本原理对其进行不断地研究和改进，使实时荧光定量PCR 得到了进一步的完善。随着实时荧光定量PCR 的不断标准化，该技术将在生物学、医学基础研究等科研领域中得到更加广泛的推广与应用。
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